ERK1/2参与IL—33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程(2)

　　1.2.4 Western blot检测α-SMA、TRAF-6、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表达细胞以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，加入200 μL RIPA裂解液（每1 mL裂解液中加10 μL PMSF），冰上裂解30 min，超声，4℃、12000 rpm离心10 min，取上清。Bradford法测定蛋白含量。4∶1体积比加入上样缓冲液，100℃ 5 min变性。每孔上样等量总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。30v转膜150 min，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h。TBST洗膜3次，分别加入一抗α-SMA（1∶1000稀释）、TRAF-6、ERK1/2和p-ERK1/2（1∶400稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入对应二抗（1∶500稀释），室温孵育1 h。最后BCIP/NBT显色液暗处显色观察，凝胶成像系统扫描分析，磷酸化水平用磷酸化蛋白和总蛋白的相对值表示，目的蛋白水平用目的蛋白和内参蛋白的相对值表示。各组实验均重复3次。

　　1.3 统计学分析

　　数据采用SPSS 13.0 统计学软件进行，所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响

　　加入10 ng/mL IL-33刺激细胞培养24、48、72 h 后，各组细胞生长状态良好，随着培养时间的延长，细胞数量不断增多。MTT结果显示，与未刺激组比较，IL-33明显诱导细胞增殖（P<0.05），见表1。

　　2.2 IL-33对TRAF-6 mRNA和蛋白水平的影响

　　与对照组相比，TRAF-6 mRNA和蛋白水平均明显上升（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33诱导心脏成纤维细胞时，活化其下游信号。

　　2.3 IL-33对p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达的影响

　　Western- blot 结果显示，IL- 33刺激心脏成纤维细胞后ERK1/2总蛋白无明显变化，而p-ERK1/2蛋白表达明显升高，与对照组比较，有显著性差异（P<0.05），见图1和表2。表明IL-33/ST2-TRAF-6 信号通路激活后，引起下游ERK1/2通路的参与。

　　2.4 IL-33对α-SMA mRNA和蛋白水平的影响

　　α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白。我们结果显示，IL- 33刺激成纤维细胞24 h后，α-SMA mRNA和蛋白表达明显上调（P<0.05）；40 μM PD98059预处理60 min后，α-SMA水平较单纯刺激组显著减弱，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1和表3。表明IL-33诱导了心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，这一过程可以被ERK1/2特异性阻断剂所抑制。

　　3 讨论

　　心力衰竭是各种危重心血管疾病的终末阶段，由于心肌损伤，引起心肌间质纤维化、心肌肥大和心功能不良，限制心肌细胞活动，降低心室顺应性，影响心肌的收缩和舒张功能，导致心脏重构[6，7]。在慢性炎症过程中，有多种炎症细胞参与，并释放多种炎症因子，导致肌成纤维细胞的形成并大量分泌ECM，最终导致纤维化[2，8-9]。因此确切认识心肌纤维化发生机制，有针对性地采取措施，进而有效预防和逆转心肌纤维化，对心衰的早期治疗也有着重要意义。

　　研究发现IL-33广泛存在于多种组织和细胞上，如成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞，在哮喘、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎症、抗动脉粥样硬化、抗心肌细胞肥大和心肌纤维化的过程中发挥重要作用[10]。IL-33可特异性激活ST2，ST2基因编码产生两种蛋白：跨膜形式ST2L和分泌形式sST2。在生物机械压力的诱导下，心肌细胞和心脏成纤维细胞均能表达ST2。在IL-33/ST2信号通路中，IL-33与ST2L、IL-1受体辅助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）组成受体复合物，活化下游信号TRAF6、转化生长因子相关-1（TAK1），进而激活p38、JNK、NF-kB 等通路发挥生物学作用。sST2可负向调节IL-33/ST2通路的传导[4]。有研究证实，TRAF6 是IL-33介导p38、JNK 和NF-kB活化的关键信号分子[5，11-13]。本研究发现，IL-33能诱导心脏成纤维细胞明显表达TRAF-6，表明有IL-33/ST2通路的激活。

　　促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在许多心血管疾病的发病机制中起着重要作用，如心肌肥厚、心肌纤维化及心力衰竭等[13，14]。MAPK包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/应急激活的蛋白激酶（SAPK）及细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）三条通路，其中ERK1/2是心肌梗死后心室重塑的重要信号通路之一[15，16]。有研究报道，醛固酮通过激活ERK1/2 而刺激心脏成纤维细胞增殖，而且抑制ERK1/2活化能抑制IL-1β 诱发的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）分泌[15-17]。我们的研究结果发现，在心脏成纤维细胞中IL-33 /ST2 通路活化后能进一步激活下游ERK1/2通路。已知α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白，成纤维细胞增殖、活化后其表达升高。本研究通过IL- 33诱导建立纤维化细胞模型，在这一过程中α-SMA 基因和蛋白水平明显表达，并且这一效应能被ERK1 /2特异性阻断剂PD98059所阻断。因此，IL- 33能诱导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，这一过程有IL-33/ST2-TRAF-6- ERK1/2通路参与调控。当然目前对IL-33在心肌纤维化中的作用机制还有待于进一步阐明，期望能为心肌纤维化治疗研究提供新思路。

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