ERK1/2参与IL—33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程

　　[摘要] 目的探讨ERK1/2通路在IL-33激活心脏成纤维细胞中的表达及其作用。方法培养心脏成纤维细胞，10 ng/mL IL-33刺激细胞，不同时间点MTT法检测IL-33对心脏成纤维细胞增殖的影响；RT-PCR检测细胞标志性基因α-SMA 及通路关键分子TRAF-6的mRNA表达水平；Western blot检测α-SMA 、TRAF-6及p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表达。结果 IL-33能促进心脏成纤维细胞的增殖（P<0.05）；IL-33刺激细胞24h，TRAF-6表达显著上调（P<0.05），p-ERK1/2 蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.05）；IL-33干预24h后α-SMA表达明显上调（P<0.05），ERK1/2特异性阻断剂PD98059可有效抑制该效应。结论 ERK1/2通路参与了IL-33诱导的心脏成纤维细胞增殖和纤维化过程。

　　[关键词] IL-33/ST2信号通路；ERK1/2；心脏成纤维细胞

　　[中图分类号] R363 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）34-0004-04

　　心肌纤维化是心脏重构的重要组成部分，贯穿于心力衰竭发生发展的整个过程。已知心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFBs）过度增殖，胶原合成增多，排列紊乱是心肌纤维化的细胞病理学基础[1]。CFBs在应激下可转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoFBs）[2，3]，合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）能力增强。平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纤维细胞的标记性蛋白。

　　白细胞介素-33（interleukin，IL-33）是近年来新发现的细胞因子，2005年被鉴定为白细胞介素-1（IL-1）类家族新成员。IL-33 与其受体ST2结合后，将活化信号传导到胞内，诱导Th2 细胞因子的产生，参与多种炎症反应和免疫应答[4，5]。其中肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）是IL-33介导下游信号传导的关键信号分子。最近研究显示，IL-33/ST2与纤维化疾病存在密切联系，在肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化以及皮肤纤维化等纤维化疾病中发现 IL-33和/或ST2表达水平发生了变化。IL-33/ST2在心肌纤维化过程中发挥的具体作用机制，还有待于进一步研究。本实验旨在研究IL-33对心脏成纤维细胞增殖及纤维化过程中关键蛋白分子表达的影响以及下游通路活化的影响，探讨IL-33与心肌纤维化的关系，为进一步明确心肌纤维化的发病机制及寻求新的治疗靶点提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　大鼠心脏成纤维细胞由本实验室保存。DMEM/F12培养基、胎牛血清购自HyClone公司。重组IL-33购自美国Peprotech公司，MTT试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠α-SMA抗体、TRAF-6抗体购自SANT CRUZ公司。兔抗大鼠ERK1/2和p-ERK1/2购自CST公司，内参GAPDH抗体购自Biolegend公司，碱磷酶标记山羊抗兔二抗、碱磷酶底物BCIP/NBT显色浓缩液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ERK1/2特异性阻断剂PD98059购自美国Sigma公司。蛋白Marker购自美国Fermentas公司。RIPA 蛋白裂解液购自碧云天公司，RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。根据GenBank序列设计引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养大鼠心脏成纤维细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

　　1.2.2 MTT 比色法检测细胞增殖实验取对数生长期细胞，以0.5×104/孔接种于96孔培养板中，每组设5个复孔，并设调零孔，每孔体积200 μL。细胞经IL-33分别诱导24、48及72 h，每孔加MTT 20 μL（5 mg/mL），继续孵育4 h。终止培养，吸弃上清，每孔加DMSO 150 μL，置摇床上低速振摇10 min，使结晶充分溶解。酶联免疫仪490 nm测吸光度值。上述实验重复3次。

　　1.2.3 RT-PCR检测标记性基因 α-SMA及信号通路关键因子TRAF-6的mRNA表达变化取对数期生长细胞，消化后调整密度至5×105/mL 接种于培养瓶。无血清培养基同步化饥饿12 h，再以10 ng/mL IL-33诱导24 h，其中检测α-SMA时用40μM PD98059预处理60 min，RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA。α-SMA上游引物：5'- ACTCTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3'，下游引物：5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGCT-3'；TRAF-6上游引物：5'- TCTCCCCTGCCTTCATTGTT-3'，下游引物：5'-AGGCTGGCGAT-TTTGTGTTT-3'；β-actin上游引5'-ACGGTCACAG-GTCATCACTATCG-3'，下游引物：5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察扫描并进行电泳条带分析，以目的条带与β-actin条带的比值作为目的条带的相对值。各组实验均重复3次。

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